【摘要】本试验通过对幽门螺杆菌(Hp)培养的营养条件和微需氧环境的摸索,得出其较佳的培养方法是采用心脑浸液血琼脂培养基,选用焦性没食子酸法,焦性没食子酸的最佳用量为0.9g/100ml,使Hp的球形体仅为10%,而且该方法具有操作方便,费用低廉等优点.蜂胶各种溶剂提取物对Hp都有很好的抑菌效果,以95%乙醇提取物的抑菌能力最强,60%乙醇提取物次之,而水提取物的抑菌能力最差.
【作者】 钟立人 韩文辉 陈荷凤
【关键词】蜂胶 幽门螺杆菌(Hp) 焦性没食子酸
前言
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称Hp)感染是一种很常见的慢性细菌感染,它是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因素[1][2]。当前根治Hp感染的较好方法有以质子泵抑制剂 (PPI)为基础的三联7d疗法、以胶体铋(CBS)为基础的三联低剂量14d疗法和7d疗法[3]。抗生素的耐药性给治疗带来困难,加之存在使用抗生素的费用和副作用等问题促使人们寻找价格低廉而疗效较高的符合国情的治疗方案。本文对幽门螺杆菌的培养和各种蜂胶提取物对其抑制作用进行了研究,从而为Hp感染的治疗提供一定的依据。
1 材料和方法
1.1材料和仪器
(1)蜂胶各种溶剂提取物[4] :本实验室制得
(2 )GENbox anaer:bioMerieux(法国梅里埃公司 )
(3)实验菌种 :幽门螺杆菌ATCC11673:购自上海第二医科大学 ;枯草杆菌 :本院微生物实验室提供
(4)培养基:Columbia:bioMerieux(法国梅里埃公司);心脑浸液琼脂、肉浸液琼脂、普通营养琼脂和布氏肉汤
(5)GENbox:bioMerieux(法国梅里埃公司)1
2 实验方法
1.2.1 用于Hp的最佳培养基和最佳培养方法的选择。
1.2.1.1 用于Hp的最佳培养基的选择采用Columbia培养基、心脑浸液琼脂、肉浸液琼脂、普通营养琼脂以及它们的血琼脂培养基,用GENbox和GENbox anaer在37℃下72 h培养后进行比较。
1.2.1.2 用于Hp的最佳微需氧培养方法的选择先用Columbia血琼脂培养基 ,接种Hp后,按以下方法培养:
(1)装入GENbox,加入GENbox anaer后,37℃下培养72 h。
(2)生物厌氧法:取三块平皿,先接入强需氧菌(枯草杆菌 ),再分别于37℃培养1h、2h和3h后,打开皿盖,将三块接种Hp的平皿倒扣在上,用封口膜密封 ,使强需氧菌迅速进入对数生长期而旺盛生长,吸收培养基中的氧气。
(3)连二亚硫酸钠法[5]:取无菌平皿加入等量连二亚硫酸钠和无水碳酸钠 (加量按1.0g/100ｍl),立即将接种Hp的平皿倒扣在上,用封口膜密封,并混合均匀于37℃下培养72h。
(4)焦性没食子酸法[5]:取无菌平皿加入焦性没食子酸(加量按1.0g/100ml),将接种Hp的平皿倒扣在上 ,迅速加入等量10%NaOH后 ,立即用封口膜密封,并混合均匀于37℃下培养72h。
1.2.1.3 培养基、培养方法与Hp球形体的关系
采用心脑浸液血琼脂培养基和Columbia血琼脂培养基,每种培养基接种Hp5块。取10块无菌平皿,分成二组,每组加焦性没食子酸和10%NaOH,其用量按器皿的容积计算。每组焦性没食子酸用量按0.9g/100ml、1.0g/100ml、1.1g/100ml、1.2g/100ml和1.3g/100ml加入,后将接种Hp的平皿倒扣在上,迅速加入10ml10%NaOH后,立即用封口膜密封,并混合均匀于37℃下培养72h。
1.2.2 蜂胶对Hp的抑菌作用
用6号新华滤纸经打孔器打成若干直径为6mm的圆形滤纸片,置于121℃高压蒸汽灭菌30min。将各种蜂胶提取物用95%乙醇配成0.2%的蜂胶溶液。用无菌镊子分别夹取已灭菌的滤纸片,浸入不同溶剂提取的蜂胶溶液中,5分钟后,取出,干燥使乙醇完全挥发后备用。
菌液的制备:将保存的Hp,移种于新鲜的培养基上培养48小时,镜检时70%以上为弯曲型。用布氏菌肉汤洗下,制成10×105-6CFU/ml浓度的菌液备用。用上面选择的培养基来倒平板,在每个平板上加一定数量的菌液,均匀涂布。然后贴上各种样品的纸片,每个平板贴4张纸片。厌氧培养72小时后,在明亮的光线下,用卡尺测量纸片周围完全无Hp生长的最短直径为抑菌环直径。
2 结果与分析
2.1 用于Hp的最佳培养基和最佳培养方法的选择
2.1.1 用于Hp的最佳培养基选择(结果见表1)
从表1可见,Hp在不加羊血的培养基里都不能生长,说明血中含有促进Hp生长因子。而在普通营养琼脂上,尽管加入羊血还是不能生长,说明普通营养琼脂不能满足Hp生长所必须的营养物质。肉浸液琼脂加羊血后,Hp虽能生长,但生长远不如心脑浸液血琼脂和Columbia血琼脂好。
2.1.2 用于Hp的最佳微需氧培养方法比较 (结果见表 2 )
从表2可见,生物厌氧法不适合Hp的培养。
连二亚硫酸钠加上无水碳酸钠,能吸收氧气,造成厌氧环境,并产生二氧化碳。但是,反应较慢,需要6～8h[5],所以对Hp生长不利。而且,反应过程中可能会产生对Hp有害的物质。
用焦性没食子酸加氢氧化钠培养时,Hp生长良好。因为焦性没食子酸加氢氧化钠能迅速大量吸收氧气,生成深棕色的焦性没食子橙,是传统的化学除氧物质 ,它能在任何容器内迅速造成厌氧环境。控制好焦性没食子酸的用量可以产生适合Hp生长的微需氧环境[5] 。
用bioMerieux公司的GENbox和GENboxanaer培养的Hp生长均良好。
2.1.3 培养基、培养方法与Hp球形体的关系
Hp的一般形状为弯曲状、螺旋形或Ｓ形细菌(见图1),但在陈旧性培养基中或不利环境中形成小球形体(见图2),所以可以用球形体所占比例来表示生长环境的好坏[6]。Hp能在焦性没食子酸加氢氧化钠产生的息需氧条件下生长,但必须控制好
焦性没食子酸用量与Hp球形体的关系见表3。
从表3可见,同样在不同焦性没食子酸加等量氢氧化钠所产生的微需氧条件下,Hp在心脑浸液血琼脂上所形成的球形体明显比Columbia血琼脂少。在心脑浸液血琼脂上 ,当焦性没食子酸用量为0.9g/100ml时,所形成的球形体仅为10%,而在Columbia血琼脂上可达40%。这是因为心脑浸液除营养丰富外,还含有较多不饱和脂肪酸,能吸收培养基中的氧气,而促进厌氧菌和微需氧菌的生长。
2.2 蜂胶对Hp的抑菌作用
2.2.1 蜂胶各种溶剂提取物对Hp的抑菌作用(结果见表4)
上表是三次的实验结果的平均值,从上表可见,各种溶剂提取物对幽门螺杆菌的抑菌作用强弱为:95%乙醇>60%乙醇>乙酸乙酯>正丁醇>丙酮>乙醚>30%乙醇>5%NaHCO₃>1%NaOH、水。
2.2.2 蜂胶部分分离物对Hp的抑菌作用(结果见表5)
从表5可见,对Hp的抑菌作用主要是I,而Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ也有较强的抑菌作用。
3 结论
3.1 Hp的较佳培养方法是采用心脑浸液血琼脂培养基,选用焦性没食子酸法 ,焦性没食子酸的最佳用量为0.9g/100ml,使Hp的球形体仅为10%。
3.2 蜂胶各种溶剂提取物对Hp都有很好的抑菌效果,以95%乙醇提取物的抑菌能力最强,60%乙醇提取物次之,而水提取物的抑菌能力最差,在95%乙醇提取物的分离物,以组分I的抑菌作用最强。
参考文献：
[1] International Agency for Reserch on Cancer.Schistosomes,liver flukes and Helicobacter pylori.LARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans.1994,61:218～220
[2] Yerdorffer E ,Neubauer A ,Rudolph B .Regression of prima-ry gastric lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue after cure of Helicobacter pylori infection.Lancet,1995,345:1591～1594
[3] 萧树东,刘文忠.幽门螺杆菌感染的治疗现状.世界华人消化杂志,1999,7(1):3～4
[4] 陈荷凤,韩文辉等.蜂胶各种溶剂提取物的抑菌效果比较.食品研究与开发,2001,增刊:18～19
[5] 陈聪敏.厌氧菌及基感染.上海:上海医科大学出版社,1989
[6]陈敏章,胡伏莲,周殿元等.幽门螺杆菌感染的基础与临床.北京:中国科学技术出版社,1999
