磷酯酶A、广泛存在于许多动植物组织中, 特别是动物毒素中, 如蛇毒、蝎子毒、蜘蛛毒、黄蜂毒、胡蜂毒、蜜蜂毒， 但不同来源的蜜蜂毒磷酯酶A分子量平均为18500, 含量也不相同。蛇毒中的磷酚酶A含量平均约1一2%, 而蜜蜂毒磷醋酶A含量竞高达8~14% ,平均12 %。而它的活性远比蛇毒、黄蜂毒、胡蜂毒的高。

　　蜜蜂毒的磷酯酶A,由128个氨基酸残基组成, 其中有8个半胱氨酸由4条二硫键相联, C 末端为酪氨酸, N末端为异亮氨酸。　　

　　磷酯酶A能使血中的卵磷酚水解, 释放出一分子脂肪酸而成为溶血卵磷酯, 从而使红细胞溶解, 析出血红蛋白, 产生溶血效应, 故称间接溶血毒（多肽溶血毒meilitn为直接溶血毒) 。磷酯酶A具有很复杂的药理学作用, 它不仅作用于神经肌肉, 而且对代谢、非偶联氧化磷酸化以及呼吸链都具有抑制作用。近来又发现一些突触前神经毒素, 肌肉毒素和心脏毒素也具有磷酯酶A活性。

　　

　　磷酯酶A还具有其他重要功能如：破坏细胞膜上的磷酯层, 增加毒素的渗透力, 干扰细胞膜上的氧化磷酸化作用。它能催化天然活性物质(磷酯酰基胆碱、磷酯酰基氮乙醇以及磷酯酰基丝氨酸)水解, 促使脂肪酸从B位置释放, 在线粒体上产生分解能, 使肥大细胞脱粒,组织胺释放。

　　纯化的磷酯酶A已成为研究生物膜、磷酯酶结构和代谢以及脂蛋白关系的重要工具酶。价格昂贵。此外还发现磷酯酶A能降低动物对病毒和病菌的感染力, 对澳洲Murray山谷脑炎Newcastle病毒、A2流感病毒、葡萄球菌毒素以及Rous肉瘤、NH2肿瘤病毒有对抗作用。

　　磷酯酶A对Hela (宫颈癌) 细胞 (瘤株F315)匀起细胞毒素作用。经过磷酯酶A处理的Hela 细胞, 40%的细胞质上出现空泡小滴, 有一半Hela细胞停止发育。

　　磷酯酶A还具有辐射保护效应, 接受850拉德X照射的小白鼠可提高存活率50% , 它的辐射保护机制可能是由于溶血卵磷酯酶的释放。

　　保加利亚的S. Shkenderov (1974) 通过实验证明蜂毒引起过敏, 是由于其中高分子量的磷酯酶A及透明质酸酶引起的, 如果除去高分子量的磷酯酶A及透明质酸酶, 便可以从蜂毒中除去过敏原。埃及的A . H . Mohamed (1961) 也指出养蜂者的血液中有磷酯酶A抗体, 所以养蜂者被蜂蜇不过敏。

　　磷酯酶A在蜂毒的组份中毒性较大。例如腹腔注射小白鼠, 粗毒的半数致死量LD50为12μg /每克体重, 磷酯酶A的LD50却为0. 37μg /每克体重。

　　磷酯酶A的毒性还在于对心血管系统及神经系统都有直接的毒性作用, 能引起肺出血, 心室纤维性颤动, 直至强直性收缩, 并导致呼吸抑制至休克。

　　所以从蜜蜂毒中分离提纯磷酯酶A , 既可以得到一种昂贵的研究生物膜的工具酶, 又可以得到一种脱敏、低毒、安全性大的新型蜂毒针剂—蜂肽(苏联、英国都有了类似的针剂) 。

　　分离方法

　　西德Haberman, E (1957) 等国的许多学者都介绍了提纯磷酯酶A的方法, 其中以美国纽约大学的D. Monjal (1971) 的方法较为简单实用。用葡聚糖凝胶GFO (40) (瑞典Pharmacia产柱层析分离蜂 ( Apis mellifera)毒, 得到的磷酯酶A蛋白峰汇集, 浓缩后在磷酸盐缓冲液(含0. 4MNa2 HPO4 15ml、0.4MKH2 PO4 3.75ml、2MNaCI 9ml)加蒸馏水至100ml, 离子强度0.2，pH7. 2透析、浓缩冻干。

　　下图为我们用Sephex G75柱层析分离蜂毒所得的图谱。第二蛋白峰为磷酯酶A。

　　酶活力测定　

　　(一) 参考Baman的方法改进, 酶活力用半溶血剂量来HU50表示反应系统组成。蜂毒磷酯酶A样品(1mg/ml配在pH7.2、0.12M缓冲液中)。0. 2ml , 卵磷酯一红血球悬液(100毫克卵黄卵磷酯悬浮在上述缓冲液) ,再加入10毫升大白鼠洗涤红血球和lml 0.5MCaCI溶液, 反应总 体积1. 2ml、37℃保温30分钟后, 加8. 8ml冰冷的生理盐水停止反应, 立即离心。上清液在波长540毫微米处比色, 测定释放出的血红蛋白量。O %溶血对照不加样品, 100%的溶血对照 是用蒸馏水代替生理盐水停止反应。选择4种样品浓度使其引起的溶血百分率在0一100之间, 用溶血百分率对样品浓度的对数作图, 求出几种磷酯酶A浓度的半溶血剂量。

　　(二) 电位滴定法。 　　

以卵磷酯为底物, 用0. 2NKOH滴定酶解释放出的脂肪酸, 记录不同 时间消耗的KOH溶液的体积, 换算成磷酯酶A的比活(脂肪酸微克分子/分•毫克酶)。具体步 骤可参照陈远聪测定蛇毒磷酯酶A活力的方法: 称取卵磷酯500mg, 溶于100ml乙醚中, 加水20ml , 60℃保温约20分钟, 蒸发除去大部份乙醚 (当心着火)。用玻棒或振荡器混成均匀 的混悬液, 加入1M氯化钠l0ml, 0.01M氯化钙10ml, 0.01M脱氧胆酸钠10ml, 混匀后用2N氢氧化钠调至pH 8.0,用蒸馏水稀释至10ml , 每次取出10ml混合液作测定用。先将滴定终点 调至pH8.0 , 吸取样品溶液100/l (含粗毒或磷酯酶A l毫克), 在37℃恒温条件下, 用0.02 N的氢氧化钾溶液滴定由酶释放出的游离脂肪酸, 记录半小时内不同时间消耗的氢氧化钾溶液的毫升数, 换算成脂肪酸的微克分子数作图。以初速度的直线部份计算比活, 比活单位为释放出的游离脂肪酸微克分子数/毫克磷酯酶A•分钟。 完全提纯的磷酯酶酸活性大约比粗毒强10倍。

　　分子量的测定

　　(一) 凝胶过滤测分子量。

　　Sephadex G7540) 柱 ( 45x 2.5厘米) , 用0.05MTris HCI、pH7. 6的缓冲液 (含0.1MNaCI平衡, 附恒流泵的蛋白监测仪测定蛋白吸收峰。磷酯酶A样 品及标准蛋白质: 细胞色素C (分子量13370)、肌红蛋白(分子量15800)、胰凝乳蛋白(分子量2 5000)、卵白蛋白( 45000)、核糖核酸酶 (分子量13700)各连4～5mg , 分别溶于0.5 ml平衡缓冲液中上柱, 以蛋白质分子量的对数对凝胶过滤柱的洗脱体积作图。求得磷酯酶A分子量1850±500。

　　(二 ) SDS一聚丙烯酰胺盘电泳测分子量。 　　

磷酯酶A及标准蛋白(卵白蛋白、胰凝乳蛋白、肌红蛋白、核糖核酸酶、细胞色素C ), 将每种样品各取10mg 溶解于0.5ml的缓冲液中, 每份取10mg加入蔗糖溶液 (10%), 使其上样溶液的浓度大于缓冲液浓度。凝胶浓度T＝20%,澳酚蓝作指示剂。控制电流每管8毫安, 电泳5小时。用考马斯亮蓝染色, 7.5%的醋酸脱色, 测得各种蛋白质电泳的迁移率对蛋白质的分子量的对数作图。

　　纯度测定

　　磷酯酶A的纯度用聚丙烯酰胺盘电泳, 醋酸纤维素薄膜电泳或免疫电泳析验, 均出现一条单一的带。



　　蜜蜂杂志 1989年6期

　　中国科学院昆明动物研究所 　　钱 锐