1 引言
蜂胶是蜜蜂工蜂采集植物树脂，并混入其上颚腺和蜡腺的分泌物形成的粘性物质。蜜蜂利用蜂胶填补蜂巢空隙、抑制病菌侵袭、包埋入侵者尸体。蜂胶中含有20 多类500 多种化学成分，已经被证实具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调节血脂血糖等广泛而显著的生物学活性。蜂胶的化学成分极为复杂，其中也存在一些无明显药用价值的成分甚至有毒成分，加上蜂胶在水中的溶解度很低，部分溶于有机溶剂，所以蜂胶的提取工艺是充分利用蜂胶生物活性成分的关键步骤，选择一个合适的提取工艺对于生产高质量、高性价比的蜂胶产品至关重要。 本文在对蜂胶常用的提取方法作简要介绍的基础上，着重介绍固相萃取、天然低共熔溶剂和高压萃取等三种新型提取方法的特点及其在蜂胶提取中应用的可行性，为寻求适宜的蜂胶提取新方法和建立标准化提供参考。 蜂胶提取最常用的方法是浸渍法（Maceration），使用最多的溶剂是乙醇- 水混合物。目前已有大量文献研究不同因素对提取效果的影响，包括溶剂类型、固液比、提取时间、温度等。Yong 等研究发现浓度为60%~80% 的乙醇提取物的活性高于浓度为40%~60% 和80%~95% 的乙醇提取物。一般通过蜂胶提取物的含量、总酚和总黄酮的提取含量，抗菌和抗氧化的活力等因素来评价其提取效果。比较理想的浸渍时间为10d 左右，较长的浸渍时间（20d 或30d）所产生的液体提取物得率有轻微的增加，但多酚的含量无显著变化。蜂胶的活性成分复杂，极性各不相同，为了更多地利用蜂胶中的活性成分，除了乙醇，也有采取其他溶剂的研究，如水、油、乙二醇、丙二醇、乙酸乙酯、石油醚等。不同溶剂提取得到的生物成分和活性均有不同。马士巧等对东北黑蜂蜂胶不同极性提取物的提取率和体外抗氧化活性进行测定和比较，其中甲醇和乙醇提取物中的黄酮和三萜含量最高，多酚含量较高；而水提物的提取率仅有5.82%，但多酚含量最高；甲醇和乙醇的提取物抗氧化活性最强，而苯提取物较低。 索氏提取法（Soxhlet extraction）也是提取蜂胶活性成分的常用方法，在浸渍过程的基础上采用索氏装置提取，可以加快提取速率，并在一定程度上提高提取效率。与浸渍法相比，该方法主要的优点在于溶剂用量少，溶剂可循环使用以及提取时间较短。Biscaia等发现采用索氏提取法，溶剂为无水乙醇，提取6h，温度为60℃，质量浓度为5 ∶ 150 时，所得提取率最高；但是该方法应谨慎使用，因为蜂胶长期暴露于高温环境中会破坏其中受热不稳定的化学成分，而且会增加蜂胶中蜡物质的溶解。Archaina 等采用不同浓度的乙醇浸渍提取法和索氏提取法（60℃）提取阿根廷无刺蜂蜂胶，发现索氏提取法虽然有较高的提取率，但总酚和黄酮类化合物含量较低，抗氧化活性也有所降低。 近年来，超声波辅助萃取技术（Ultrasound-assistedextraction, UAE）应用于提取蜂胶中的活性成分。其原理是利用超声振动改变物质的形态与功能，或者加速这些改变的过程，现在普遍认为超声波技术提取的三大依据是超声波的空化效应、热效应和机械效应。UAE 可以大大缩短提取时间，节省溶剂用量，而且超声波提取过程中不需要加热，可以最大限度地保护蜂胶中的活性成分，提高提取效率。另一种技术微波辅助萃取技术（Microwave-assisted extraction, MAE），是利用微波能量加热与样品接触的溶剂，以便使基质中的一些化学成分转移至溶剂中的过程，也是一种提取蜂胶黄酮的省时、高效的方法。与传统浸提法相比，MAE 具有溶剂用量少、提取效率高、提取时间短等特点。相较于浸渍法和UAE，MAE 显然是一种更快速的提取方式，而且提取效率较高。Trusheva等研究发现，在MAE 条件下（800 W；2×10s，得率73%~75%）的提取率高于UAE（30min，得率41%~53%）和传统浸提法（72h，得率55%~58%）。但是，Trusheva 等和Oroian 等 研究发现微波辐射可能由于降解过程导致提取的活性成分比例减少，所以考虑到提取率和较短的提取时间，UAE 是更有效的提取方式。 超临界流体CO2 技术（Supercritical CO2 extraction，SC-CO2）在近几十年发展迅速，超临界流体在工业中被用作绿色环境友好溶剂，CO2 由于在加工过程中安全、低成本、再生简单、可抑制氧化等特点，常被用作超临界萃取溶剂。但是，SC-CO2 是非极性的，极性化合物在其中的溶解度较差，导致不同类型蜂胶提取物中的生物活性成分含量较低。为了增强极性和获得更多富含极性生物活性成分的提取物，加入乙醇和甲醇可作为蜂胶的助溶剂。Machado 等研究发现SC-CO2 萃取的巴西蜂胶提取物中含有的阿替匹林C和香豆素含量高于传统乙醇提取物，但是活性低于传统乙醇提取物。目前SC-CO2 成功应用于蜂胶无水乙醇提取物的分离，获得富含特定价值成分的馏分：巴西绿蜂胶的异戊烯基肉桂酸[和巴西红蜂胶的聚烯丙基二苯甲酮。 3.1 固相萃取（Solid phase extraction, SPE） 固相萃取（SPE）是结合了液固萃取和液相色谱两大技术发展而形成的样品前处理技术。传统固相萃取技术的原理是利用固体吸附剂吸附目标物，使目标物与其它基质分离，再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标物的目的。现在也已出现一些新型SPE 技术，可以减少人为因素造成的误差。为了获得高萃取回收率，选择合适的固体吸附剂始终是关键的步骤。与液-液萃取（LLE）相比，SPE 具有回收率高、分离速度较快、不易产生乳化、溶剂用量减少等优点；与高效液相色谱（HPLC）相比，SPE 的分离效率低，可用于分离差别很大的化合物；对于基质复杂、含量较低的目标物，采用SPE 法，主要起到净化、富集的作用。 早在1962 年，Anton 等就首次对SPE 技术进行了研究，并采用氧化铝作为吸附剂来净化样品，纯化效果良好。一次性SPE 商品柱出现在1978 年。自SPE 出现以来，就一直以10% 的年增长率扩大其应用。SPE 在我国起步较晚，早期使用固相萃取有机、无机样品居多，处理体液等生物样品的报道较少。 但近20 多年来，已广泛应用于环境分析、食品分析、药物分析、材料分析和化学分析中。在提取蜂胶方面，目前SPE 未被建议用于大规模的制备应用，但实验室条件下已有多项研究采用该方法。刘䶮等和王春玲采用大孔树脂从乙醇提取物中提取蜂胶黄酮类物质，纯度达90% 以上。 Li 等采用微孔吸附树脂对蜂胶水馏分中的多酚进行了分离。目前SPE 更多的是与分析仪器联合使用，相互补充，扩大使用范围，实现了前处理及分离分析的优化组合，如固相萃取- 液相色谱。杨黎等采用HLB 与NH2 固相萃取柱净化，建立高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂胶、蜂胶保健食品中的氯霉素、甲砜霉素与氟甲砜霉素的方法，结果表明该方法操作简单、灵敏度高、适用性强。杨雯筌等将样品经固相萃取、衍生、乙酸乙酯提取后进行质谱分析，建立了蜂胶中硝基呋喃类代谢物液相色谱- 串联质谱检测方法。张睿等对样品用阳离子固相萃取小柱净化，建立用HPLC-MS/MS 同时检测蜂胶中磺胺及林可胺类药物残留的方法，该方法回收率良好，检测限较低。 李俊玲等用正己烷固相萃取蜂胶中的多环芳烃，用气相色谱- 三重四极杆串联质谱联用仪测定，结果显示准确度、精密度良好。廖夏云等通过HLBSPE 小柱净化目标成分，建立同时采用液相色谱- 串联质谱法测定蜂胶胶囊中多种硝基咪唑类药物残留的检测方法，结果表明该方法简单可靠，重复性好，推广应用前景较好。Simsek 等开发了一种基于固相萃取结合气相色谱- 质谱联用的可靠且具有选择性的方法，用于测定蜂胶中的有机氯农药、多氯联苯和多溴二苯醚。 3.2 天然低共熔溶剂（natural deep eutectic solvent，NADES） 随着人们对生态环境的密切关注和对绿色化学的倡导，寻求一种新的低成本、无污染的绿色溶剂来提取生物活性天然化合物的需求也日益强烈。在过去的十多年中，天然低共熔溶剂（NADES）得到了发展。2003 年，Abbott 等首次提出低共熔溶剂（DESs）是一种由氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD）以一定比例混合加热搅拌形成的液态混合物，而天然低共熔溶剂（NADES）的概念在2011 年由Choi 等首次提出，是一种自然界中存在的类似DESs 的物质，以生物体的初级代谢产物分别作为HBA、HBD 混合形成的物质。由于NADES 由天然产物组成，与DES相比，具有成本更低、易于制备、毒性更小、可持续性更好，具有较宽的极性范围以及极性可调等优点，虽然NADES 的研究刚刚起步，但在多方面应用领域展现了巨大的潜力。目前文献中报道的NADES 均是人为地将某些初级代谢产物按一定比例混合制备而成的。 NADES 的生物相容性较好，可在医药领域发挥巨大作用，如增加药物溶解度、稳定性和渗透性，促进药物口服吸收，作为药物活性成分等。在天然生物活性成分提取方面，NADES 的溶解能力较强，采用该溶剂得到的萃取率高于传统有机溶剂，在提取和储存过程中可增加天然化合物的稳定性。在农产品残留物处理应用方面，目前研究文献显示有望利用NADES推进现有的生物炼制方法，实现木质纤维素生物质残留清洁分馏或预处理。NADES 也广泛应用于化学领域，如用于合成、催化等。Wu 等采用NADES 作为催化剂，通过分子间氢键活化途径实现了活化炔烃的选择性硒化，转化率为100%，选择性为93%。 在蜂胶提取的应用中，水- 乙醇溶剂是最常用的提取蜂胶活性成分的有效溶剂，但由于部分人群对乙醇不耐受，所以用于食品或保健品中的蜂胶乙醇提取物并不适用于所有消费者，也不符合绿色提取的原则。 而作为天然产物的NADES，具有极性范围宽且可调的优点，de los Angeles Fernandez 等采用基于NADES的超声辅助萃取法提取农副产品中的酚类物质。已有文献报道测试了一些NADES 代替水- 乙醇提取蜂胶活性成分的作用；其中适合提取巴西绿蜂胶的溶剂是氯化胆碱- 丙二醇或氯化胆碱- 乳酸，适合提取杨树型蜂胶的溶剂是氯化胆碱L（＋）酒石酸[33] 和柠檬酸-丙二醇。最近，有研究者提出，天然低共熔溶剂的组分可以提高溶解的生物活性成分的活性。Trusheva等利用天然低共熔溶剂提取蜂胶的实验已经证实这一点。这使得将获得的具有良好活性的蜂胶提取物直接引入到配方中成为可能，避免了难以从具有粘性和低蒸汽压的天然低共熔溶剂中回收溶质。 NADES 作为一种新型的绿色溶剂，已经被证明比传统的有机溶剂更有效，可以提高蜂胶提取物的得率，不过也存在缺点，主要是很难从提取的化合物中将NADES 分离出来。但是通过使用NADES 来提取仅由无毒食品添加剂组成的食品或药品，就没有必要将它从提取的化合物中分离出来。 3.3 高压萃取法（High pressure extraction，HPE） 高压萃取是指在常温下用100~800MPa 的流体静压力施加于材料，使用与传统提取法相同的溶剂在高压作用下渗透入物料内部，保持压力使物料内外压力达到平衡，一定时间后迅速卸压，此时细胞内外产生较大的渗透压力差使得物料中的有效成分转移至提取溶剂中，从而完成提取过程。高压应用于驱动各种各样的现象去促进体积减小的方向诱导反应，从而提高萃取效率（例如从一种形式到另一种形式的相变，反应动力学的变化，分子结构的变化等）。 高压技术发展迅速，且应用广泛，最初应用于陶瓷、金属等材料加工领域，在20 世纪80 年代后期逐渐应用于食品加工领域。2004 年，张守勤等首次提出将高压技术作为提取方法，并以中草药进行了适用性研究；发现使用HPE 在室温下工作可以避免一些热敏性化合物受热变性，而且萃取时间极短，得率较高，能节省大量能源，安全性也更高。 关于HPE 在蜂胶提取中的应用，张守勤等 研究发现高静压萃取（High hydrostatic pressure extraction,HHPE）浸提1min 的黄酮化合物得率高于室温浸提法7d、热回流浸提4h 的得率，证明该方法可以快速提取蜂胶中的黄酮化合物，且优于传统提取方法。席军等分别采用HHPE、室温浸提法和热回流浸提法对蜂胶乙醇提取物的抗氧化活性进行研究，发现蜂胶乙醇提取物（EEP）的抗氧化活性随着提取物浓度的增加而逐渐增强，经HHPE 和室温浸提（LRT）出的EEP 具有较强的抗氧化活性，而且两种提取法的提取物抗氧化活性相同，但是LRT 通常需要7d，HHPE只需1min。通过比较提取时间、提取效率和抗氧化活性，HHPE 比常规提取方法更有效。还有一种方法称为加压溶剂萃取（PSE），也称为加速溶剂萃取（ASE），利用了萃取的温度依赖性。温度的升高加速了提取速率，而压力的升高防止了溶剂在高于正常沸点的温度沸腾。采用该方法，在含有29% 天然表面活性剂的情况下，用热加压水提取巴西蜂胶，用乙醇- 水提取土耳其蜂胶，效果良好；两种提取物均具有良好的抗自由基活性。 总之，HPE 是一种可应用于蜂胶活性成分提取的有效方法，萃取时间极短，提取效率高，而且没有溶剂挥发，符合绿色环保要求。目前主要在实验室中使用该方法，操作简单，但该方法需要高度专业化的设备。 综上所述，蜂胶的经典提取方法和新型提取方法得到了应用和发展。不同提取方法可针对不同类型蜂胶或蜂胶中不同类型的化合物来选择，目前最常用的溶剂还是乙醇- 水混合物，考虑到对绿色化学和生态环境的关注，未来像天然低共熔溶剂这类的绿色溶剂将会有理想的发展潜力和应用前景。综合评价上述的提取方法，均有各自的优缺点，为寻求一种可以广泛应用于不同类型蜂胶中生物活性成分提取的最佳方法还需要更多的研究。
