摘要:

　　目的 测定中国大虎头蜂蜂毒毒性，制备能有效中和中国大虎头蜂蜂毒的 F( ab) 2抗体。

　　方法 小鼠腹腔注射测定胡蜂毒 LD50，以胡蜂毒免疫日本大耳白兔获得免疫血浆，经盐析、酶解、加热等步骤获得 F( ab) 2抗体，并以免疫扩散、ELISA 和小鼠 体外中和法分别测定超免血浆、纯化的IgG及制备的 F( ab) 2抗体对中国大虎头蜂及多种蛇毒的抗体效价。 　　

结果 小鼠腹腔注射中国大虎头蜂蜂毒的 LD50为0. 697 mg/kg－1，制备的F( ab) 2抗体 SDS-PAGE 电泳纯度为 94. 3% ; ELISA 检测结果表明纯化的 IgG 质量浓度为1 / 10－9 mg/mL－1时对胡蜂毒素为阳性; 免疫扩散结果表明制备的 F( ab) 2抗体与中国大虎头蜂毒素( 1∶1) 时出现明显沉淀线，该抗体与胡蜂毒质量比( 3. 5∶1) 时可保护小鼠100% 存活。 　　

结论 首次利用胡蜂毒免疫动物制备高纯度 F( ab) 2抗体，该抗体可有效中和抗中国大虎头蜂毒蜂毒，并对银环蛇毒具有交叉中和作用。

　　关键词: 中国大虎头蜂; 胡蜂毒; 毒性; F(ab) 2抗体; 制备 　

　　胡蜂也被称为马峰，是指膜翅目胡蜂总科的昆虫，全世界已知胡蜂种类有6 000余种，中国分布有208余种，在人类或家畜接近胡蜂群15 m 以内或胡蜂认为其受到威胁时，就会对人类或家畜发起凶猛攻击; 人和动物一旦受到其攻击，由于蜂毒中含有乙酰胆碱、胡蜂激肽、磷酸酯酶 A、B 在内的溶血毒素和神经毒素，健康人如果受 10～20只胡蜂蜇伤就会产生蛰伤部位红肿疼痛，受200～300只蜂蜇，则出现心血管紊乱症，500只蜂蜇，可引起肝、肾等脏器的功能衰竭，甚至因心律不齐、呼吸麻痹而导致死亡。近年来气候和环境的变化，原仅分布于沿海地区的胡蜂已向北扩展倒了陕西关中，加之我国天然林保护工程的实施，使得蜂巢不仅在农村随处可见，城市也能常见大型蜂巢分布，因此城市社区、农村、学校胡蜂伤人时间屡屡发生并呈增加趋势。同时由于现代农药的广泛使用，使得胡蜂毒素毒性较以前变得更加厉害，也使近年来胡蜂蜇人后的死亡率较以前增大。2002年来，仅陕西省一地胡蜂已致使715人受伤，36人死亡。在我国分布胡蜂当中，常见袭人的种类有基胡蜂( Vespa basalis) 、墨胸胡蜂 ( V．velutina nigrithorax) 、拟大胡蜂 ( V. analisnigrans) 、金环胡蜂 ( V. mandarinia mandarinia) 、黑盾胡蜂( V. bicolor) 、陆马峰( Polistes rothneyi grahami) 、亚非马峰( P．hebraeus) 。而中国大虎头蜂( V．manderinia) 是其中具有较强的攻击性和毒性的一种胡蜂，其常见于我国西南地区，特别是云南热带、亚热带地区常有其蜇人事件发生。由于其体型大，一次排毒量较大，因此人畜一旦受到其攻击，往往症状都比较严重。另由于大虎头蜂喜在低矮的灌丛、草丛及土洞和石缝下筑巢，人们容易接近但又易忽视，这也使得大虎头蜂袭人事件频发。目前对蜂蜇伤的治疗，主要是采用常规吸氧、补液、脱敏抗休克及对症处理，尽管也有一定疗效，但往往病程较长，治疗效果并不理想，另胡蜂蛰伤后若未及时救治或救治方法不当，极易引起多脏器功能衰竭。目前笔者未见有关中国大虎头蜂蜂毒毒性质及其 LD50 的相关报道。对生物毒素中毒的治疗抗血清仍是最有效的药物，但目前笔者尚未见我国有利用蜂毒制备抗血清的研究报道，如果能研制针对蜂毒的抗血清用于胡蜂蜇伤的治疗，那么将会大大缩短蜂蜇伤治疗时间，降低蜂蜇伤的致死率。蜂毒由于其中大部分毒素成分相对分子质量较小，其免疫动物后能否获得满意的免疫效果未知。本实验选取中国大虎头蜂蜂毒作为免疫原，进行蜂毒抗血清的制备研究，为我国日益增多的蜂蜇伤利用抗血清进行治疗提供科学依据。本实验首次对江浙蝮蛇等毒蛇中的神经毒素和抗血清之间的交叉作用进行了研究，为能否利用现有血清对严重胡蜂蛰伤病人进行有效救治提供了科学依据。

　　1 材 料

　　中国大虎头蜂( Vespa manderinia) 采自云南省西双版纳傣族自治州，经云南农业大学动物东方蜜蜂研究所谭垦研究员鉴定为中国大虎头蜂; 日本大耳白兔( 普通级) ，昆明种小白鼠［清洁级，体重18～22 g，合格证号: SCXK( 滇) 2005-0008，昆明医学院实验动物中心］; 弗氏不完全佐剂( Sigma 公司，批号: 112K8930) ; 中相对分子质量标准蛋白质( marker，上海升正生物技术有限公司) ; 辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG( Sigma公司) ; Sephadex G25，AKTA explorer 蛋白纯化系统( GE公司) ; 眼镜蛇毒( 批号:20090501，LD50 : 0. 93 mg/kg － 1 ) ，眼镜王蛇毒( 批号: 20080602，LD50 : 1. 25 mg/kg－1 ) ，银环蛇毒( 批号: 20080602，LD50 : 0. 03 mg/kg－1 ) ，金环蛇毒( 批号: 20080312，LD50 : 0. 60 mg•kg－1 ) ，江浙蝮蛇毒 ( 批号: 20080312，LD50 : 1. 75 mg/kg－1 ) ; 所有蛇毒均购自广东新源蛇毒厂，LD50均为腹腔注射剂量; 抗眼镜蛇毒血清( 批号: 20080801，SDS-PAGE 纯 度: 87. 6% ) ，抗银环 蛇毒血清 ( 批号: 20081001，SDSPAGE 纯度: 91. 3%，上海赛伦生物制药有限公司) ，抗血清为本所生物工程实验室制备; Sunrise Remote 酶标仪( 澳大利亚，TECAN) ; 其余所有试剂均为国产分析纯。 　　

　　2 方 法

　　2. 1 蜂毒制备

　　取新采集的来自于同一种群的多个胡蜂成蜂活体，尾部剖解取毒腺后立即进行研磨，3 000 r/ min－1，4℃离心15 min，取上清即蜂毒溶液，蜂毒溶液测定蛋白浓度后置－80℃保存备用。

　　2. 2 LD50的测定

　　LD50采用简化寇氏法测定，小鼠80只，分成8组，每组10只，将蜂毒溶液按照蛋白浓度配制成一系列剂量，进行腹腔注射，观察小鼠死亡情况，剂间距离之比为 (1∶0. 8 )，最小剂量为0. 36 mg • kg－1，以同样体积生理盐水注射小鼠作为对照。 　　

　　2. 3 免疫

　　将已除菌的蜂毒液与弗氏不完全佐剂等量混合，利用乳化器进行充分乳化。测定乳化效果后，置4 ℃冰箱于12 h内使用。选取14～16 周龄的健康雄性日本大耳白兔2只，采用背部皮内多点注射法，首次免疫剂量蜂毒0. 08 mg; 此后间隔1周加强免疫1次，连续免疫5周，每次剂量递增0. 03 mg。

　　2. 4 采血

　　首次免疫前及每次免疫时从兔耳静脉采取血样，间接 ELISA 法测定血清效价。第5次免疫后两周心脏采血，血浆按终质量浓度为5 mg/mL－1 加入枸橼酸抗凝剂，5000 r/min －1，4℃离心30min，取上清即血浆原液。

　　2. 5 IgG 纯化

　　取“2. 4”项下免疫血浆50 mL，搅拌下缓慢加入固体硫酸铵使终质量浓度为0. 5 g/mL－1，连续搅拌1 h 后，离心后倾去上清，沉淀以原血浆体积注射用水溶解后，再次加入固体硫酸铵，其终质量浓度为0. 33 mg/mL－1，搅拌20 min后离心，取沉淀用10 mL 注射用水溶解后透析至溶液导在1 ms/cm－1以下时离心，取上清。各步离心条件为8000 r/min－1，20℃，30 min。 　　

　　2. 6 F( ab) 2抗体制备

　　取“2. 5”项下制备的IgG 溶液，加入甲苯使终质量浓度2 g/mL－1，以 6 mol/L－1 HCl 调pH值至3. 5，按0. 1 g/L－1加入胃酶( Sigma公司，比活1∶3 000) ，置31℃培养箱酶解6 h后以5 mol/L－1 NaOH 调pH 值至5. 2 终止反应。酶解液加入硫酸铵，使硫酸铵终质量浓度为 0. 15 mg/mL－1，完全溶解后置57℃，30 min，取出待温度降至45℃以下，离心，取上清进行G25 柱色谱脱盐，脱盐液冻干后－20℃保存。

　　2. 7 纯度检测

　　SDS-PAGE 电泳参照分子克隆实验指南进行，电泳胶板用 Bio-Rad Gel doc EQ 凝胶成像系统进行图象采集后，使用 Quantity One 4. 4 凝胶分析软件进行分析计算 IgG 及 F( ab) 2抗体纯度。

　　2. 8 蛋白浓度测定

　　按照双缩脲法［12］测定各样品的蛋白浓度。

　　2. 9 ELASA 抗体滴度测定

　　用 0. 05 mol/L－1碳酸盐缓冲液( pH 9. 6) 分别稀释蜂毒和5种蛇毒，使蛋白终质量浓度为 0. 5 mg/mL－1 后包被酶标板，4℃过夜后洗板; 将待测样品用稀释液( 含10% 小牛血清的PBS 缓冲液，pH 7. 4) 进行10、102 、103 、104 ……1010 稀释后加入酶标板中，每个样品3孔，并以免疫前的健康兔血清作阴性对照，37℃结合2 h; 洗板后加入 HRP 标记的羊 抗兔 IgG，37℃ 结合2 h; 洗板后加入邻苯二胺 ( OPD) 显色液，避光显色 30 min; 2 mol/L －1 H2 SO4 终止反应; 置自动酶标分析仪测定 A492 nm值。以 S /N≥2( S: 样本 A，N: 阴性对照 A) 作为阳性。以上各步样品均每孔100 /L。

　　2. 10 免疫扩散实验

　　参照文献方法，中间孔加入蜂毒( 1 mg/ mL－1 ) ，周围孔分别加入倍比稀释的待检抗体样品 ( 1～24 mg/mL－1 ) ，至湿盒中室温放置24 h 以上，氨基黑(5 mg/mL－1 ) 染色，脱色液脱色至背景基本 无色后观察。
　　2. 11 小鼠体外中和实验

　　小鼠 66 只，分为11组，每组 6只，♀♂ 各半。注射蜂毒量为3LD50，以硼酸盐缓冲液分别稀释蜂毒、抗胡蜂毒抗体和抗蛇毒抗体，抗胡蜂毒抗体与蜂毒按质量比 1∶1、2∶1、3∶ 1……10∶1，抗蛇毒抗体与蜂毒按质量比 20∶1、30∶1、40∶1……120∶1 混合摇匀后置37℃结合45 min ip 注射小鼠，每只0. 4 mL; 对照组为硼酸盐缓冲液与蜂毒混合后，同样条件下注射小鼠，观察72 h 并记录小鼠死亡情况。

　　3 结 果

　　3. 1 中国大虎头蜂毒 LD50测定结果

　　小鼠腹腔注射中国大虎头蜂蜂毒的 LD50 为0. 697 mg/kg－1，LD50的可信限为0. 652 ～0. 744 mg/kg－1 ( mortality =0. 95) 。注射剂量及死亡率见表1。

　　表1　 中国大虎头蜂蜂毒的半数致死量( LD50 ) 测定结果 n = 10 　　（略）

　　3. 2 IgG 纯化及 F( ab) 2制备结果

　　通过两步硫酸铵沉淀法纯化后的 IgG 纯度为85. 3%，31℃消化6 h IgG 酶解为 F( ab) 2及 Fc 片段，结果见图1，经过硫酸铵盐析后的 F( ab) 2抗体纯度为94. 3%。

　　图1 　IgG 酶解和纯化的 F( ab) 2 片段 SDS-PAGE图 　　（略）

　　3. 3 效价测定

　　3. 3. 1 酶联免疫吸附实验 抗大虎头蜂蜂毒兔免疫原血浆稀释至1 /10－7 mg/mL－1与免疫前兔血浆作对照呈阳性; 纯化后的 IgG 稀释至1 /10－9 mg/mL－1 时呈阳性，纯化后的 ELISA活性提高了100倍。与含有神经毒素的蛇毒的交叉中和实验表明纯化后的 IgG 稀释至1 /10－3 mg/mL－1能与银环蛇毒发生交叉中和反应呈阳性，但制备的 IgG 即使在12. 5 mg/mL－1时与金环蛇毒、眼镜蛇毒、江浙蝮蛇毒和眼镜王蛇毒都不发生交叉中和反应，ELISA 检测结果均为阴性，结果见表 2。 　　

　表2　 抗大虎头蜂胡蜂毒 IgG 与各毒素交叉中和 ELISA 检测结果

　　3. 3. 2 免疫扩散实验

　　“2. 4”项采集原血浆与胡蜂毒质量比在 6∶1 时出现清晰沉淀线，而纯化后的 IgG与胡蜂毒质量比在 1∶1时出现清晰的沉淀线，结果见图2( 中央孔为毒素) ; 制备的F( ab) 2抗体与胡蜂毒在质量比1∶1时出现清晰沉淀线，但与银环蛇毒需在质量比32∶1 时方可出现沉淀线，与金环、眼镜、眼镜王和江浙蝮蛇毒素都未出现免疫沉淀线。

　　图2 　免疫血清和纯化后的 IgG与大虎头蜂毒的免疫扩散图 　（略）

　　3. 3. 3 小鼠体外中和实验 

　
　　制备的抗中国大虎头蜂毒 F( ab) 2抗体冻干品与中国大虎头蜂毒质量比在 3∶1 时即可保护小鼠100% 存活; 抗银环蛇毒 F( ab) 2抗体冻干品与中国大虎头蜂毒需在 60∶1 时 才可保护小鼠100% 存活; 而眼镜蛇毒 F( ab) 2抗体与中国大虎头蜂毒无交叉中和作用，不能有效中和胡蜂毒素，结果见表 3。

　　表3 　不同 F( ab) 2抗体对中国大虎头蜂毒的小鼠体外中和实验 n = 6　　　（略）

　　4 讨 论

　　由于中国大虎头蜂毒性大且造巢于地底，很难捕捉，因此很少见有关此蜂 LD50的报道。本实验进行小鼠腹腔注射测定了中国大虎头蜂的LD50为 0. 697 mg/kg－1，与文献报道的其他蜂类的半数致死量比较，其半数致死量要小很多，是蜜蜂神经毒素的1 /6，是蜂毒肽的1 /12; 与毒性较强的蛇毒比较，除大于银环蛇 LD50外，皆低于其他我国常见陆生毒蛇的 LD50，其半数致死量甚至比金环蛇毒( 1. 0 mg/kg－1 ) 的腹腔半数致死量还低，加之胡蜂毒素易引起人体严重的过敏性休克，因此在我国南方，特别是在南方热带山岳丛林地区作业或旅游的人们如果碰到中华大虎头蜂攻击是非常危险的，如果不及时进行有效救治，比其他胡蜂攻击更易引起严重症状导致死亡。胡蜂毒具有神经毒和溶血毒性，本实验测定 LD50的过程中发现，在给小鼠注射高剂量胡蜂毒以后20 min，小鼠就出现呼吸急促、眼球发白、痉挛等症状。解剖死亡小鼠后发现，在注射低剂量胡蜂毒时，死亡小鼠内脏出血症状明显; 而注射高剂量胡蜂毒的死亡小鼠内脏没有出血现象，主要因呼吸麻痹而死亡，这也说明中国大虎头蜂毒素同样含有这2种毒素。

　　根据制备抗蛇毒血清的研究，用硫酸铵沉淀法制备的抗胡蜂毒兔血清 IgG 的纯度不及马抗蛇毒血清IgG纯度，经过同样条件盐析纯化得到的抗胡蜂毒兔IgG含有较多的杂蛋白。这可能跟马血清和兔血清中所含包括IgG 在内的各种血浆蛋白性质不尽相同有关，酶解后的F( ab) 2抗体经过一次硫酸铵盐析和57℃加热处理能除去大部分的Fc片段，从而使 F( ab) 2抗体纯度大幅度提高，但同时也会损失一部分F( ab) 2，如果加热温度和时间控制不恰当也会使 F( ab) 2抗体活性大受影响，因此摸索酶切后柱色谱方法进行纯化更易在提高纯度的同时保持抗体活性。

　　胡蜂毒素广泛含有磷脂酶 A2 ( PLA2 ) 这一类神经毒素，并且是蜂毒中的主要毒性蛋白和抗原蛋白，也是主要的过敏原。眼镜蛇、眼镜王蛇和江浙蝮蛇毒中也含有这一类神经毒素，银环蛇和金环蛇毒中含有的神经毒素主要为α-银环蛇毒素和β-银环蛇毒素，但制备的抗中国大虎头蜂 IgG 和 F( ab) 2抗体能与银环蛇毒发生交叉中和反应，却不能与金环、眼镜、眼镜王 和江浙蝮蛇毒产生交叉中和，而且抗银环蛇毒血清能在 60∶1 时保护小鼠存活，这说明中国大虎头蜂毒素与银环蛇毒中的某些组分可能有共同的抗原决定簇，其中还主要包括某些毒性成分，但这两种毒素中具有共同特性的这些毒性成分还不清楚，也未见相关研究。另同为 PLA2，胡蜂毒素与蛇毒 PLA2的差别有多大，它们之间是否是两类不同结构的 PLA2有待于进一步研究。由于抗银环蛇毒血清与胡蜂毒素在60∶1 时可保护注射致死剂量胡蜂毒素的小鼠存活，因此在临床上对于受到胡蜂攻击而导致严重症状的患者提示可使用抗银环蛇毒血清进行急救。

　　由于胡蜂种类繁多，我国常见蜇人胡蜂种类在7 种以上，这些胡蜂毒素目前只有部分有 LD50和一些成分的基因研究，从报道的溶血多肽来看，不同种系的序列差异并不大，长黄胡蜂与黄胡蜂间的抗原交叉反应活性高于长黄胡蜂与马蜂间的和黄胡蜂与马蜂间的，且3种变应原的交叉反应活性大小顺序为: 透明质酸酶＞抗原5 ＞磷脂酶，针尾昆虫的毒素变应原的近70% 序列有交叉反应活性，因此推测抗虎头蜂蜂毒抗体也能中和其他胡蜂毒素，但交叉中和抗体效价是多少仍需进一步研究。制备的IgG 纯度即使达到95%以上，也因 IgG 相对分子质量高达150 /103左右，作为异源蛋白是非常容易引起人体免疫反应而导致过敏的，IgG酶解后获得的 F( ab) 2片段能保持中和毒素的活性而分子量降为100 /103左右，同时由于去除了主要引起过敏反应的Fc 片段，因此可大大降低过敏反应的发生率，这也是目前世界上绝大多数国家生产的抗毒素血清其主要有效成分都是 F( ab) 2或 Fab片段的原因。由于目前在抗血清的制备上全世界基本采用的是马进行免疫，兔血清血量较少，其安全性也还需进行验证，因此目前并不能用于人用抗血清的制备。但野生胡蜂毒素的采集较为困难，获得足够的大动物免疫量并不容易，如果能够利用基因工程方法获得含有胡蜂毒素中多个关键抗原表位的新型免疫原对制备广谱抗胡蜂毒素抗体将具有重要意义。

　　本实验中抗体效价的测定采用的是蛇毒抗体效价检测通用的小鼠体外中和法，但抗体的实际能否有效中和已经进入体内的毒素，与体外中和毒素的效价比例关系如何等还需建立动物模型进行体内中和实验进行检测。

　　参考文献 REFERENCES 　　（略）

　　郑颖，余方芳，叶锋平，崔庆华，邱薇，张向荣，张琳，聂雪峰，范泉水* ( 成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所，昆明 650032)

　　基金项目: 重大新药创制国家科技重大专项( 008ZXJ09004-039) ; 全军十二五医学科研面上项目( CWS11J280) 　　

　　作者简介:

　　郑颖，女，副主任医师研究方向: 抗毒素血清及蛋白类药物 *

　　通讯作者:

　　范泉水，男，博士，研究员，博士生导师研究方向: 免疫学、病毒学 Tel: ( 0871) 4775694 Fax: ( 0871) 4775701 E-mail: fqs168@ 126. com

　　中国药学杂志 　　2013年5月第48卷第9期